用途

Realtime RT-PCR

說明

本試劑盒是通過以高效率逆轉錄酶ReverTra Ace為逆轉錄酶和以Tth DNA Polymerase為PCR酶的兩酶體系，進行一步法熒光定量PCR的試劑盒。主要使用TaqMan分析法進行熒光定量PCR。因為逆轉錄反應與PCR在同一反應體系中連續進行，反應液的分裝操作一次就可以結束，適用于高通量分析。另外，樣品間交叉污染的危險性也降低了。本產品中，兩種酶與最優化過的buffer組分相組合，可以對微量RNA進行迅速定量。對RNA病毒及表達量低的mRNA的定量有利。另外，不易受目的基因序列的影響，可高靈敏度地檢測出各種各樣的RNA。 

特征

● 迅速?高靈敏度
通過使用Probe的One-step qRT-PCR，可迅速且高靈敏度地對微量RNA進行定量。

● 序列偏差的降低
不易受目的基因序列的影響，可高靈敏度地檢測出各種各樣的RNA。
將多重檢測（Multiplex）時各目的基因擴增的偏差降至最低。

●混雜物抗性的提高
可避免因血紅素等的PCR抑制劑導致的靈敏度下降。

●使用dUTP
通過添加Uracil-N-Glycosylase(UNG)*，能夠防止因Carryover污染而導致的假陽性發生。

* 本產品中不含有UNG。

實驗例

1. 腸道病毒RNA的高靈敏度檢測

將腸道病毒RNA作4倍稀釋，使用TaqMan probe法，與其他公司的產品比較檢測靈敏度及定量性。引物、TaqMan probe是直接使用論文記載的序列（沒有進行優化處理）。用Applied Biosystems^®、StepOnePlus^™進行分析。

2. 各種病毒檢測靈敏度的比較

制備11種病毒RNA的4倍稀釋系列溶液，使用TaqMan probe法，進行最高檢測靈敏度的比較。引物、TaqMan probe是直接使用論文記載的序列。用Applied Biosystems^®、StepOnePlus^™進行分析。

將各試劑能檢測到的最低拷貝數連線作圖。

結果顯示：只有用本試劑盒時，才能對所有的目的基因以30個拷貝以下的靈敏度進行檢測及定量。通過這個實驗表明，本試劑不受目的片段序列的影響，能以高靈敏度檢測到各種各樣的RNA。

3. 多重熒光檢測（Multiplex）體系中的表達定量

使用三種熒光標記的TaqMan探針，分別用單獨檢測及一次使用三種TaqMan探針的多重熒光檢測體系，分析IL-1β、TNF-α、GAPDH基因的表達量。

實驗中以HeLa S3 RNA（1pg~100ng的10倍稀釋【6個梯度】）為樣品，用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96進行分析。

結果顯示，各基因用單獨（圖1）及使用三通道的多重熒光檢測（圖2）分析中得到了相同的靈敏度，PCR效率及相關系數并沒有太大的差異（表1）。

產品內容

【QRZ-101】
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
DNA Polymerase125μl
RT Enzyme Mix125μl
50× ROX reference dye100μl
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
(50μl體系100次，或20μl體系250次)

【QRZ-101S】
2× Reaction Buffer500μl
DNA Polymerase25μl
RT Enzyme Mix25μl
50× ROX reference dye^*20μl
2× Reaction Buffer500μl
(50μl體系20次，或20μl體系50次)

*ROX溶液是另外添加的，可以對應幾乎所有的熒光定量PCR檢測儀器。

基本反應條件

RNase free waterXμl
2×Reaction Buffer25μl
DNA Polymerase1.25μl
RT Enzyme Mix1.25μl
Forward Primer25pmol
Reverse Primer25pmol
TaqMan^® probe10pmol
RNA溶液Yμl
50× ROX Reference dye^*11/0.1μl
(Uracil-N-Glycosylase1unit^*2)

Total Volume50μl

*1 50×ROX reference dye，是對于使用 Passive Reference 的儀器（如Applied Biosystems 公司制造的儀器等），為校正各孔間的熒光強度及分注誤差而使用。不用 Passive Reference 進行校正的儀器無需添加。

*2 使用Uracil-N-Glycosylase(UNG)處理時，請使用熱敏性(heat-labile)UNG?？筛鶕鞴就扑]的條件，調整酶的用量。

Cycle
(20～25℃    10min.^*3)
          ↓
50℃    10min.
          ↓
95℃    1min.
          ↓
95℃    15sec.
60℃    45sec.　40～45 cycles

*3 進行UNG處理時，請在逆轉錄反應前，設定UNG反應步驟。上述表示的是一般溫度條件及反應時間，請根據各公司的推薦條件進行調整。