用途

Realtime RT-PCR

說明

Tth DNA polymerase是在Mn²⁺存在下，具有很強的逆轉錄活性的獨特的酶，在單一反應體系內可進行cDNA的合成及PCR的連續反應。利用該特性，開發出單酶一步法定量PCR試劑盒，與在同一反應中使用RTase及Taq DNA polymerase的「兩酶一步法」體系試劑相比，使用單酶時，最適反應條件的設定較容易，而且能夠得到更高的分析效率。

特征

●一步法高通量分析
本品以RNA為模板，能夠在同一反應體系內進行定量PCR分析，非常適合于需要快速分析的多重檢測體系。

●特異性高
本品采用抗體法熱啟動，對控制非特異性擴增非常有效。

●適用性廣
探針法及SYBR^®Green I 法都可以適用。

●可用于不同類型的儀器
因為含有參比染料（Passive reference），可適用于需要校正的檢測儀器(如Applied Biosystems^®StepOnePlus^TM等)。

●可用于易于形成高級結構的RNA和高GC含量的模板
可用于使用玻璃毛細管型的檢測儀器(如Roche Diagnostics公司的LightCycler^® )。
逆轉錄反應在高溫下進行，所以也適用于易于形成高級結構的模板RNA。而且，眾所周知，Tth DNA polymerase對GC含量高的序列的擴增效率非常高，可有效檢測GC含量高的目的片段。

實驗例

1.與『兩步法體系(RTase + Taq)』相關性的比較

通過以各種人組織來源的RNA為樣品，對蛋白酶δ（PKCδ）的表達進行分析，比較了與使用一般的兩步法的熒光定量PCR分析法的相關性。
黃色柱狀圖表示的是使用本產品的定量結果，左邊是使用50ng、右邊是使用200ng的Total RNA得到的結果。藍色柱狀圖表示的是使用本公司高效率逆轉錄試劑盒「ReverTra Ace -α-^®」[FSK-101]與Taq酶為基礎的熒光定量PCR試劑「SYBR^®Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]組合的兩步法體系檢測的結果。

結果顯示，使用一步法的本產品與兩步法體系得到了相同的結果。

2. TaqMan^®探針法分析的性能比較

RNA-direct^TM與兩酶一步法(儀器:使用BioFlux公司的Line Gene)
以mRNA為模板，與使用Taq+RTase混合型的A公司的試劑(兩酶一步法體系)進行了比較實驗。
以人培養細胞提取的mRNA（10ⁿ倍稀釋系列(n=2)）為模板，用TaqMan^®探針法對β-actin的mRNA進行檢測（作100倍稀釋，使用20μl反應液中含有5ng的Poly(A)⁺RNA）。結果顯示，使用RNA-direct^TMRealtime PCR Master Mix的反應中，即使使用A公司試劑推薦的反應條件，也會得到起峰早及直線性的良好結果。

3. SYBR^®Green分析法中直線性的討論

RNA-direct^TM與兩酶一步法（儀器:使用ABI公司的PRISM^®7900HT）
以HeLa細胞來源的Total RNA（10ⁿ倍稀釋系列(n=2)）為模板,用SYBR^®Green分析法檢測β-actin的mRNA（作100倍稀釋，使用20μl反應液中含有75ng的Total RNA）。
結果顯示，與Taq+RTase混合型的B公司試劑盒相比，RNA-direct^TMSYBR^®Green Realtime PCR Master Mix的反應中，至少可以在7個梯度的稀釋系列中表示出高度相關性。

4. SYBR^®Green分析法中性能的比較

RNA-direct^TM與一酶一步法(儀器:使用Roche公司的LightCycler^TM)
以人培養細胞提取的Poly(A)+RNA（10ⁿ倍稀釋系列(n=2)）為模板，用SYBR^®Green分析法檢測G3PDH 的mRNA (作100倍稀釋，使用20μl反應液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。
結果顯示，與同樣使用Tth DNA Polymerase的C公司試劑相比，RNA-direct^TMSYBR^®Green Realtime PCR Master Mix的檢測中，起峰早、信號強以及檢測靈敏度都得到了極大提高。

產品內容

〈QRT-101, QRT-201〉
Master Mix0.5ml ×5支
50mM Mn(OAc)₂0.5ml ×1支
(50μl反應體系可使用100次，20μl反應體系可使用250次)


保存 -20℃(避光保存)

基本反應條件

〈SYBR^® Green I 法〉
使用ABI PRISM^®7900HT(Applied Bio.)
滅菌水X μl
Master Mix25μl
50mM Mn(OAc)₂2.5μl
各Primer10pmoles each
RNA樣品<1μg

Total Volume50μl

Cycle
90℃    30sec.
61℃    20min.
        ↓
95℃    60sec.
        ↓
95℃    15sec.
^*55～65℃    15sec. 45cycles
74℃    45sec.

※退火溫度，請根據引物的Tm在55～65℃范圍內進行調整。