PCR
KOD FX Neo是在高成功率PCR酶KOD FX的基礎上添加了「延伸增強劑」而開發的PCR酶。在保持高擴增效率的同時，進一步提高了對難擴增序列、微量模板DNA、長目的片段及粗樣品的擴增效率。
●特征1. 延伸性UP
?以基因組DNA為模板最大可擴增40kb的片段
?實現了30 sec/kb的高速循環（粗樣品推薦1min/kb）
?最適用于高GC含量目的片段的擴增
此外，還適用于使用抗體的熱啟動法，可進行特異性良好的擴增。
●特征2. 對粗樣品的擴增性能UP
?提高了對植物裂解液、小鼠尾巴的擴增效率
?降低了土壤成分、食品成分等的PCR抑制效果
?與基礎版產品KOD FX一樣，可對革蘭氏陽性菌、酵母、霉菌等直接進行PCR
KOD DNA Polymerase具有卓越的延伸性，同時對粗樣品成分中的抑制物質有很強的抵抗力。
KOD FX就是利用這種特性而開發出來的高成功率PCR酶，該酶在難擴增序列及粗樣品的擴增方面受到了廣泛的好評。
然而，以KOD FX為代表的以往的PCR酶在20~30個循環以后，很容易出現擴增無法持續的<停滯現象>，PCR的功能無法完全發揮出來。
【KOD FX Neo】是在KOD FX的基礎上，應用了本公司新開發的【延伸增強劑】技術，從而成功地抑制了<停滯現象>，進一步提高了對長目的片段、難擴增序列及粗樣品等的擴增效率。
使用KOD FX Neo及以往的產品，以人基因組DNA為模板進行長鏈目的片段的擴增。結果顯示，只有使用KOD FX Neo的情況下，才可以確認擴增40kb長的目的片段。另外，與以往產品相比，KOD FX Neo只需一半的延伸時間(30sec/kb) *。因此，可以極大地縮短反應時間。
*粗樣品擴增時建議按1min/kb進行。
以人基因組DNA為模板進行檢測靈敏度的比較。結果可見，與原產品相比，KOD FX Neo的靈敏度提高了約10倍。
以堿裂解法制備的鼠尾裂解液為樣品，擴增3種小鼠的基因。結果可見，只有用KOD FX Neo才能得到良好的擴增。像這樣，KOD FX Neo能夠對樣品進行直接PCR，可以省略掉繁雜的純化過程。
使用96孔PCR板的鼠尾處理方法(堿裂解法)
將鼠尾(約3 mm)放入離心管中。
↓←添加50 mM NaOH 180μl，蓋上蓋子，用Vortex充分振蕩
↓spin down（輕輕地振蕩使液體落到管下部)
↓95℃, 10 min.孵育(使用Thermo cycler)
↓←添加1 M Tris-HCl (pH 8.0) 20μl，蓋上蓋子，用Vortex充分振蕩
↓spin down（輕輕地振蕩使液體落到管下部)
取0.5?2μl上清(模板)添加到50μl反應體系中進行PCR反應
※鼠尾切片，請切得小一些，使之能夠浸沒在裂解液中。
※請注意熱堿。
※處理后，鼠尾不會完全溶解。大約只能溶解鼠尾的表面。
※本方法，可使用1.5m的離心管。
腐殖酸(humic acid)是存在于腐殖土及土壤中的紅褐色或黑褐色有機物質，對PCR有抑制作用。
通常進行的DNA純化過程中不能去除這種腐殖酸，因此，以環境、生態體系中的樣品作為模板進行PCR非常困難。
這里，以人基因組DNA中混入腐殖酸為例，探討了其對PCR的抑制作用。結果顯示，KOD FX Neo對抗腐殖酸的能力最強。
因此，使用KOD FX Neo可以對環境、生態體系中的樣品進行PCR。
產品內容
[KFX-201]
KOD FX Neo (1U/μl)200μl×1支
2×Buffer for KOD FX Neo* [KFX-2B]
1.7ml×3支
2mM dNTP**[NTP-201]1ml×2支
*含有終濃度2.0mM的Mg2+。
** 使用本酶進行PCR時，請使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs，有時可能得不到良好的擴增性能。
※50μl反應體系的情況下可使用200次。
活性的定義:
在75℃活性測定條件下，在30分鐘內攝入10nmoles的全核苷酸使成為酸不溶物時所需酶的活性定義為1U。
來源:
E.coli 重組體
基本反應條件
滅菌蒸餾水X μl
2×PCR buffer for KOD FX Neo25μl
2mM dNTPs10μl
10pmol /μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD FX Neo(1.0U/μl)1μl
Genomic DNA10～200ng
Plasmid DNA1～50ng
cDNA ～200ng(RNA相當)
粗樣品 ～2μl
〈一步法植物裂解液1μl〉
Total Volume50μl
〈2步法循環〉*
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb 25～45 cycles
〈3步法循環〉*
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
Tm℃, 30sec.
68℃, 30sec./kb 25～45 cycles
〈Step down循環〉*
94℃,2min.
↓
98℃,10sec.
74℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
72℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
70℃,30sec./kb 5 cycles
↓
98℃,10sec.
68℃,30sec./kb 15～30 cycles
↓
68℃,7min.
*基本上以2步法循環進行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循環未見擴增時，請試一下3步法循環。另外，擴增10kb以上的目的片段時，如果出現Long PCR片段或非特異條帶及彌散，請試一下Step down循環。
※Tm值采用最鄰近法(Nearest Neighbor method)計算得到的值。引物的Tm值以及擴增產物的Tm值計算請點擊此處進入在線工具
<堿裂解法>
1) 將鼠尾(約3mm)放入離心管中。
2) 添加50mM NaOH 180μl。
3) Vortex充分振蕩。
4) 95℃?10min.
5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。
6) Vortex充分振蕩。
7) 離心(12,000rpm, 10min.)
8) 取0.5～2μl上清進行PCR反應。
(鼠尾不會也無需完全溶解)
<一步法>
1) 將葉片(3mm)或精米(1粒) 放入離心管中。
2) 添加Buffer A* 100μl。
3) Vortex充分振蕩。
4) 95℃?10min.
5) Vortex充分振蕩。
6) 離心(12,000rpm, 10min.)
7) 取1μl上清進行PCR反應。
(植物組織不會也無需完全溶解)
*Buffer A:
100mM Tris-HC(l pH9.5)
1M KCl
10mM EDTA
長按屏幕識別二維碼
打開手機掃描二維碼
