用途

Realtime PCR 用cDNA的合成

說明

SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR[Code No. SCQ-401]是通過熒光定量PCR進行基因表達分析用的、由細胞裂解試劑(Lysis Reagents)和逆轉錄反應試劑(RT Reagents)組成的試劑盒。使用本產品，可以從用96孔板等培養的細胞開始，簡便地制備含有能用作逆轉錄模板的RNA的細胞裂解物。而且，本試劑盒中含有的逆轉錄反應試劑，針對于從該細胞裂解物開始的逆轉錄反應進行了優化。

以前的SCQ-101，在Lysis Solution處理后，必需要添加Stop Solution。SuperPrep^®II 中，Lysis Solution處理后，可直接進行cDNA合成步驟。另外，可以使用更多種哺乳類細胞進行高靈敏度地檢測。使用本試劑盒，可以簡便、迅速地從培養細胞開始合成熒光定量PCR用的模板cDNA。

SuperPrep^®ⅡCell Lysis Kit for qPCR [Code No. SCQ-501]是單獨銷售的細胞裂解試劑（Lysis Reagents）?？梢允褂帽竟镜腞NA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code No. QRT-101, QRT-201) ,THUNDERBIRD^®Probe One-step qRT-PCR Kit (Code No. QRZ-101)等1-step法RealtimePCR試劑進行分析（簡易測定）。

特征

●無需純化RNA
可簡便地從培養細胞開始制備能用作逆轉錄反應模板的含有RNA的細胞裂解液。以Lysis Solution 處理的裂解液為模板，可直接進行逆轉錄反應，所以可大幅度縮短分析時間。

●從裂解液合成高品質的cDNA

通過優化的buffer組成，有效地抑制了因RNase等的細胞成分引起的RNA的降解（制備的裂解物中的RNA可在冰上穩定保持6小時）。另外，因為用gDNA Remover (DNase I)處理后再進行cDNA的合成，所以可以合成基因組DNA污染少的高質量的cDNA。逆轉錄試劑是用本公司的高效率逆轉錄酶「ReverTra Ace^®」進一步優化后的Master Mix，可簡便、高效率地合成cDNA。合成的cDNA可長期保存。

※Master Mix中Random 引物和Oligo dT引物按最適比例進行了混合。

●可用于多種類型的哺乳類細胞
SuperPrep^®II 在提高了細胞裂解性能的同時，也降低了RNase的影響。與以前的SCQ-101相比，可使用更多種類的細胞進行分析。已確認下表中的代表性細胞可適用于本品。

          細胞名稱     貼壁／懸浮           種類                       細胞                                                       來源

●降低了高通量分析時的誤差

按照本操作步驟，移液分管及稀釋操作步驟減少，降低了高通量分析時的誤差。另外，細胞裂解時無需用移液槍頭上下吹打混勻，而且同時可進行gDNA Remover處理，提高了操作性。無需添加反應終止液及引起RNA不穩定的加熱操作。

●可以與各種熒光定量PCR試劑組合使用

可以與各種各樣的熒光定量PCR試劑（SYBR^®Green I, TaqMan^®assay兩種都可以）組合使用。

另外，與本公司的THUNDERBIRD^®Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101 、KOD SYBR^®qPCR Mix (Code No. QKD-201)等組合使用，已確認可以從培養細胞開始簡便且高度準確的進行基因表達分析。而且，與本公司的RNA-direct™Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的1-step熒光定量PCR試劑組合使用，可進行簡易的分析。

實驗例

1. 純化RNA與細胞裂解液的Ct值相關性的檢驗

使用SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code No. SCQ-401)，從2.5x10⁴個H UVEC (人臍帶靜脈內皮細胞)細胞開始合成cDNA(40μl 反應體系)。另外，從HUVEC 細胞抽提的Total RNA66.6ng 開始，使用ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix (Code No. FSQ-201) 進行cDNA的合成(40μl 反應體系)。分別以各自的cDNA 為模板，使用THUNDERBIRD^®SYBR^®qPCR Mix (Code No. QPS-201)對15種House Keeping Gene進行熒光定量PCR。
結果顯示，這次分析的15種基因，純化RNA與使用細胞裂解物分析得到的結果具有良好的相關性。

2.細胞裂解液在冰上穩定性的確認

使用SuperPrep^®II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code No. SCQ-401)，將4x10⁴個HeLa S3 細胞制備成細胞裂解液，轉移到冰上，0 ～ 6小時后，取樣細胞裂解液，立即進行cDNA 的合成。同樣方法，本公司原來的產品(SuperPrep^®) 及A公司的試劑制備細胞裂解液，同樣時間點取樣，進行cDNA合成。以該cDNA為模板，使用THUNDERBIRD^®Probe qPCR Mix (Code No. QPS-101)進行熒光定量PCR對GAPDH基因的表達進行分析。
結果顯示，可以確認HeLa S3 細胞在冰上放置6 小時，Ct值也不會有顯著延遲。

3.懸浮細胞的96孔板分析及基因表達分析的實驗例

【SCQ-401】
(Lysis Reagents)
Lysis Solution                 6.5ml×1支
gDNA Remover                 33μl×1支
RNase Inhibitor               110μl×1支

(RT Reagents)
5×RT Master Mix             860μl×1支
5×RT Mastre Mix no-RT control 
                                       86μl×1支
Nuclease free Water      1,700μl×2支

【SCQ-501】
Lysis Solution                  6.5ml×1支
gDNA Remover 　　　　 　33μl×1支
RNase Inhibitor 　　　　   110μl×1支

基本反應條件

<Lysate的制備>
按以下比例(1個反應)向Lysis Solution中添加
RNase Inhibitor 和 gDNA Remover
  Lysis Solution     58.7μl
  RNase Inhibotor       1μl
  gDNA Remover       0.3μl
               ↓
向含有細胞的各孔中添加Lysis Solution 
(含有RNase Inhibitor 及 gDNA Remover)
 60μl
               ↓
振蕩30sec.后，室溫溫育4min.30sec.
               ↓
冰上

<逆轉錄(RT)反應>
按以以比例(1個反應)在冰上制備RT Master Mix
  5x RT Master Mix     8μl
  Nuclease-free Water 24μl
               ↓
每孔32μl分裝
               ↓
添加裂解液8μl
               ↓
37℃,15min.
50℃, 5min.
98℃, 5min.