用途

Realtime PCRcDNA的合成

說明

ReverTra Ace^®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)是使用高效率逆轉錄酶「ReverTra Ace^®」開發的Realtime PCR用的逆轉錄試劑盒。是含有逆轉錄反應必需的全部組分的5x濃度的完全預混型試劑，只要添加模板RNA與水，就能迅速地開始反應。另外添加了能強力分解DNA的gDNA Remover，在逆轉錄反應前對模板RNA進行處理，就可以簡便地制備無基因組DNA的cDNA。最適用于待檢測目的基因中存在假基因，或在跨越內含子位置不能設計引物，以及模板RNA中殘存有基因組DNA污染等問題時的Realtime PCR實驗。

特征

●與Realtime PCR試劑的配合性良好

采用了對RealtimePCR反應體系影響最小的組分，即使在PCR中添加最多20%的逆轉錄反應液，也可以得到很高的直線相關性。最適用于表達量低的mRNA的高靈敏度檢測。

●簡便、迅速地去除基因組DNA

只要依次添加去除基因組DNA的試劑和逆轉錄反應試劑，約20分鐘就可以制得不含基因組DNA的cDNA。

●完全預混型試劑

本品為放置于-20℃也不會凍結的完全預混型試劑。只要添加模板RNA和水，就可以簡便高效率地合成cDNA，且重復性良好。

●容易配制逆轉錄反應的陰性對照

因為添附有相同的預混型no-RT對照，能夠方便地配制逆轉錄反應的陰性對照。

●可得到更廣的可定量擴增區域

將Oligo dT 與Random Primer按最適比例預混，可均一、高效地在RNA全序列范圍內進行逆轉錄，因此可得到更廣的可定量擴增區域。

實驗例

1. gDNA Remover對基因組DNA去除效果的確認

為了確認gDNA Remover對基因組DNA的去除效果，按以下條件進行了逆轉錄反應，接著以β-Actin為目的基因進行Realtime PCR。結果顯示，用gDNA Remover處理(+)、逆轉錄(-)<以下③>的條件時，沒有擴增出現，可以確認基因組DNA已被去除掉。

●cDNA合成
試劑:ReverTra Ace^®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover
模板:自己制備的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反應體系
條件:使用gDNA Remover添加(+)、或無添加(-)的4x DN Master Mix，進行gDNA去除反應之后，分別用5x RT Master Mix II或5x RT Master Mix II no-RT Control進行逆轉錄反應。

●Realtime PCR
試劑:THUNDERBIRD^®SYBR^®qPCR Mix (Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA2μl/20μl反應體系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
測定:Applied Biosystems 7900HT

2.與其他公司同類型產品基因組DNA去除能力的比較

在HeLa total RNA中添加過量的人基因組DNA，與其他公司同類型試劑盒進行基因組DNA去除能力的比較模擬實驗。結果顯示，ReverTra Ace^®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover在基因組DNA去除方面效果更加明顯。

●cDNA合成
試劑:ReverTra Ace^®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No.FSQ-301)及同類型其他公司的試劑盒2種
模板:HeLa total RNA(0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 100ng, 1μg)+ 人 gDNA 100ng/20ul反應體系
條件:按各公司試劑盒的推薦條件進行

●Realtime PCR
試劑:THUNDERBIRD^®SYBR^®qPCR Mix(Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA 2μl/20μl反應體系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
測定:Applied Biosystems 7900HT

產品內容

gDNA Remover 10μl×1支
4x DN Master Mix 440μl×1支
5x RT Master Mix II 400μl×1支
5x RT Master Mix II
no-RT Control [FSQ-301NC] 40μl×1支
Nuclease-free Water 1,000μl×2支

※10μl反應體系情況下，可以使用200次。

注意事項

本試劑盒中附帶的5x RT Master Mix II與本公司的姊妹產品ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix(Code No.FSQ-201)中含有的5x RT Master Mix組成不同。
請務必使用本試劑盒附帶的5x RT Master Mix II。

基本反應條件

(RNA的變性)
RNA在65℃處理5min.
↓
置于冰上
(gDNA去除反應(DNase反應))
Nuclease-free Water  Xμl
4x DN Master Mix
(gDNA Remover 添加完畢)  2μl
RNA template  0.5pg～0.5μg
Total volume  8μl
↓
37℃, 5min.
(4℃)

(cDNA合成)
上述反應液  8μl
5x RT Master Mix II  2μl
Total volume  10μl
↓
37℃, 15min.
98℃, 5min.
  4℃, hold.