1鏈cDNA的合成
RNaseH活性在cDNA合成中，會分解作為模板/引物的DNA-RNA雜交體中的RNA，導致反
應效率下降。而本酶可降低該RNaseH活性。ReverTra Ace®通過在M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase基因的RNaseH活性結構域導入點突變，降低了該活性。
另外，RNA的高級結構會阻礙RTase反應的進行，使得cDNA合成困難。本酶通過在DNA合成結構域導入點突變，提高了反應效率及高溫反應性能，所以可在高溫下進行反應。因此，可通過提高反應溫度來緩和模板RNA的高級結構，可促進RTase對cDNA的合成反應。
另外，本酶比原有的deletion型M-MLV RTase RNaseH−相比，高出其約4倍的活性，可高效率地進行cDNA合成。
●提高了延伸性
去除了M-MLV RTase的RNaseH活性，延伸性有了明顯的提高。
●提高了反應效率?高溫反應性
通過在M-MLV RTase的DNA合成區域中導入點突變及改良反應組分，提高了高溫反應性和反應效率。
●最適合于RT-PCR
可在各種條件下進行逆轉錄反應，特別適用于RT-PCR。
1. 42?60℃時的cDNA合成反應
以帶有poly(rA) Tail，長度分別為9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kb的RNA 0.4μg為模板，以oligo(dT)2025pmoles為引物，在42?60℃的反應條件下，用本酶100U，進行30min.的cDNA合成反應。
結果顯示，用ReverTra Ace，在42℃及50℃時生成了9.49kb、55℃生成了4.4kb、60℃生成了2.37kb的cDNA合成產物。
2. cDNA合成效率的比較
以在in vitro條件下合成的G3PDH的RNA 102?105copies為模板，使用G3PDH的下游引物，42℃、20min.進行cDNA合成反應后，加入G3PDH上游引物，用rTaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201)進行PCR反應。
結果可見，用ReverTra Ace，即便是以102copies的RNA為模板合成的cDNA為模板，也可確認到擴增產物。
3. 14kb的cDNA合成反應
以Human骨骼肌poly(A) RNA為模板，使用dystrophin mRNA的3'端的特異性cDNA合成用引物，42℃、30min.進行cDNA合成反應后，使用mRNA的5'端特異性PCR引物對（位于cDNA合成引物上游14kb處），用KOD Dash(Code No.LDP-101)進行PCR，判斷有無延伸。
結果可見，使用ReverTra Ace，可合成14kb以上的cDNA。
產品內容
ReverTra Ace®(100U/μl) 100μl
5×Buffer* (TRT-1B) 1ml
*5×Buffer中不含有dNTPs。
組分:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
100mM NaCl
0.1mM EDTA
10mM DTT
0.01% Nonidet® P-40
50% Glycerol
活性的定義:
以Poly(rA):Oligo(dT)20為模板/引物，在42℃下，10分鐘內攝入1nmole的dTTP使成為酸不溶性沉淀物時所需的酶量為1U。
純度:
50U的本酶和0.2μg的MS2 RNA在42℃下反應1小時，RNA電流模式未見變化。
來源:
E.coli 重組體
基本反應條件
滅菌蒸餾水 Xμl
模板RNA
total RNA 100-1000ng
poly(A)+ RNA 50-500ng
Primer
oligo(dT) 5pmoles
random 25pmoles
gene specific 5pmoles
5×Buffer 4μl
10mM dNTPs 2μl(1mM)
ReverTra Ace®(100U/μl) 1μl(100U)
RNase Inhibitor 1μl
Total Volume 20μl
30℃, 10min*
42℃, 20-60min.
99℃, 5min.
*該步驟只在使用Random Primer時需要。
<1st strand DNA合成>
滅菌蒸餾水Xμl
poly(A)+ RNA 0.4μg
oligo(dT) 25pmoles
5×Buffer 4μl
10mM dNTPs 2μl(1mM)
ReverTra Ace®(100U/μl) 1μl(100U)
RNase Inhibitor 20U
Total Volume 20μl
42℃, 30min.
99℃, 5min.
長按屏幕識別二維碼
打開手機掃描二維碼
