用途

定點突變導入（置換、缺失、插入）

說明

本品是利用KOD -Plus-高保真性，以Inverse PCR法進行位點特異性突變導入的試劑盒。本方法以質粒DNA為模板，使用反向設計的引物擴增質粒全長，進行突變導入。 

特征

●導入突變的多樣性
在正常突變導入的基礎上，可進行數10bp的插入(如Tag的插入)及數百bp的缺失突變。另外，也可通過導入不同的堿基突變來創建氨基酸的點突變文庫。
●導入突變的可靠性
最大可得到95%的突變導入效率。另外，將PCR錯配產生的2nd-site mutation(目的突變以外的突變)的可能性降到最低。已確認對最長11kb的質粒進行了突變導入。
●操作簡便
轉化之前只要3步的簡單步驟。另外，無需準備磷酸化引物。

原理

實驗例

1.缺失及插入突變時效率的比較
以7.3kb的質粒FLJ32066為對象，使用本產品與A公司的non-PCR法試劑盒，進行90個堿基的缺失及6×His對應的18個堿基的導入。結果顯示：用其他公司的試劑盒難于進行的缺失及插入突變導入，使用本產品時可以高效率地獲得突變體。

2. 目的外突變(2nd-site mutation)的插入頻率評價
以試劑盒附帶的對照質粒(4.3kb)為模板進行突變導入(以8循環進行PCR)，從得到的突變體中任意選取24個克隆，以2000bp長度分成幾段分別進行測序。結果顯示：使用本產品，在實際分析的總共48,000堿基中，只有一個目的以外的堿基發生突變。與A公司的non-PCR法試劑盒相比較，也是同等以上的效果。

產品內容

KOD -Plus-
10x Buffer for iPCR
2mM dNTPs
Dpn I
T4 Polynucleotide Kinase
Ligation high
Control Plasmid
Control Primer #1
Control Primer #2
活性的定義:
在75℃活性測定條件下，在30分鐘內攝入10nmoles的全核苷酸使成為酸不溶物時所需酶的活性定義為1U。
來源:
E.coli 重組體

注意事項

●本試劑盒中使用的酶與KOD -Plus-相同。

●10×Buffer for iPCR是進行了最優化的本試劑盒專用buffer。

*各酶溶液(KOD -Plus-, Dpn I, T4

 Polynucleotide Kinase)中，雖然含有屬于消防法危險物品 第4類 著火性液體 第3石油類水溶性液體的50%的甘油，但是在著火點測定試驗中已確認不屬于危險物品。

基本反應條件

KOD-Plus-(1U/μl) 1μl

10×Buffer for iPCR 5μl

2mM dNTPs 5μl

Forward Primer 15pmoles

Reverse Primer 15pmoles

模板Plasmid　DNA 50ng

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Total Volume 50μl

Cycle

94℃, 2min.

    ↓

98℃ 10sec.

68℃ Xmin. 4?10 Cycles