多重PCR
亞硫酸氫鹽處理的DNA的擴增
KOD -Multi & Epi-™是使用基因改良的KOD DNA polymerase (UKOD)而開發的高保真性PCR酶。
通過改良，含較多尿嘧啶的模板及含次黃嘌呤核苷的引物也可以使用了。而且，因添加了延伸加速劑等組分，延伸性提高了，針對不同序列及擴增長度，不易于引起擴增偏差。
因此，KOD -Multi & Epi-™可用于多重PCR及亞硫酸氫鹽處理后的DNA的擴增（表觀遺傳學分析）、metagenome分析等各種各樣的用途。另外，該酶保真性是Taq polymerase的11倍，得到的擴增產物可通過克隆，用于原來的測序分析及高通量測序等廣泛用途。
●均一地擴增（低偏差）
可以在1 kb以下的短片段至10 kb左右的長鏈目的片段這一廣范圍內進行高特異且均一性的多重PCR。將因GC偏差引起的對擴增的影響降到了最低程度、可均一地擴增基因組及轉錄組的各種區域的片段。
利用這一特性，可制備用于下一代測序分析的擴增產物。
●含有較多尿嘧啶DNA的擴增
可對亞硫酸氫鹽處理后的含有較多尿嘧啶的DNA進行高效率地擴增。已確認最大可擴增約1.5 kb。
●可使用含有I或U的引物
以前的高保真性PCR酶，使用含有I或U的引物時擴增困難，KOD -Multi & Epi- 則可以使用這類引物進行分析。
●高保真性
是Taq polymerase保真性的11倍（與KOD FX Neo相同），擴增產物可用于各種用途。
●可擴增粗樣品
不易受粗樣品的影響，比如使用血液樣品，還可對動植物的裂解物進行基因分型，甚至對土壤、食品樣品等進行擴增。
●高效率
因為添加了延伸增強劑，提高了PCR效率，單重PCR最短延伸時間可以縮短到15 sec./ kb。
※粗樣品、使用亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品及進行長鏈多重PCR時，為了提高效率，延伸時間推薦設為30~60 sec./ kb。
1. 多重PCR性能比較
使用純化的人基因組DNA及血液樣品，對1kb以下及1~10kb的多數的目的片段，用各種PCR酶進行多重PCR性能的比較（50ul反應體系）。結果顯示，只有使用KME時，才能在所有的條件下得到偏差性低的良好結果。KME不易受血液成分的抑制，可以得到與用純化的基因組DNA擴增相同的偏差小的擴增結果。
2.使用NGS對長鏈（10kb）目的片段的多重擴增時偏好性的驗證
用6種PCR試劑對10種10kb的目的片段（其中5種目的片段的GC含量在70%的區域含有300bp以上的長度）進行擴增，將確認能擴增的試劑的PCR產物純化后用Covaris®片段化，使用Truseq®nano LT kit制備文庫，使用Miseq®(illumina)進行測序分析。以Read數最多的目的基因為基準（1.0），將各個Read數的比值作成圖。
電泳結果顯示，雖然泳道3，5中用A公司的試劑也得到了良好的擴增，但是NGS分析的結果中，產生了擴增偏好性。另一方面，KME在10種目的基因中，因為Read數的比值在0.6~1.0之間，可見均一性良好。
3.亞硫酸氫鹽處理過的DNA的擴增效率的比較
沒甲基化的C用亞硫酸氫鹽處理后轉變成U，通過PCR測序分析，就可以與甲基化的C區別開。通過這樣處理，目的片段序列中的AT含量變高，另外因為被片段化后，通常亞硫酸氫鹽處理過的DNA的擴增比較困難。
以亞硫酸氫鹽處理過的Jurkat細胞來源的甲基化DNA（55ng）為模板，用各種DNA聚合酶擴增900~1500bp的片段進行比較。結果顯示，大約1.5kb以內的目的片段，用KME都能得到一個良好的擴增結果。然后進一步對于1583bp的擴增產物，使用克隆試劑盒（Target Clone-Plus-）進行克隆之后，進行測序分析，可以確認亞硫酸氫鹽處理過的目的片段也得到了擴增（數據沒有在此出示）。
另外，對于TGF (917bp)，進行模板量的探討。結果顯示，可以檢測到最低5ng的量。通過亞硫酸氫鹽處理可以使DNA片段化，KME對于這樣處理過的樣品，也可以高靈敏度地檢測到約1kb的目的片段。
4.含有次黃苷酸（I）的引物擴增效率的比較
根據E.coli的DNA聚合酶Ⅰ的氨基酸序列設計含次黃苷酸（I）的兼并引物，用KME和KOD-PLUS- Ver.2（原來的產品）進行擴增。
結果顯示，通過使用KME，可使用用原來的KOD DNA聚合酶等高保真性PCR酶不能使用的含有I的兼并引物進行擴增。同樣也可使用含U的引物進行擴增。
產品內容
KOD -Multi & Epi-(1U/μl)200μl×1支
2×PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-1.7 ml×3支
※50μl反應體系的情況下可使用200次。
※2×PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-中含有dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)及Mg2+(終濃度2.0mM)。
注意事項
*酶溶液中雖然含有消防法危險物 第4類 易燃液體 第3石油類 屬于水溶性液體的50%的甘油，但是已確認在著火點測試實驗中不屬于危險物。
基本反應條件
(1)單重PCR反應條件
滅菌蒸餾水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
模板～200ng(Genomic DNA)
～50ng(Plasmid)
～200ng〔RNA相當〕(cDNA)
～5μl(粗樣品)
KOD -Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl
Total Volume50μl
〈2步法循環〉
[引物Tm值高于65℃時]
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 15～60sec./kb 30 cycles
Cycle(2)
〈3步法循環〉
[引物的Tm值低于65℃時]
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
Tm℃, 10sec.
68℃, 15～60sec./kb 30 cycles
(2)多重PCR反應條件
滅菌蒸餾水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
模板Genomic DNA ～200ng
Plasmid DNA ～50ng
cDNA ～200ng(RNA相當)
粗樣品～5μl
KOD -Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl
Total Volume50μl
〈2步法循環〉
[引物的Tm值高于65℃時]
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
68℃, 15～60sec./kb 25 cycles
Cycle(2)
〈3步法循環〉
[引物的Tm值低于65℃時]
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
Tm℃, 30sec.
68℃, 15～60sec./kb 25 cycles
(3)使用亞硫酸氫鹽處理的DNA進行PCR的反應條件
反應液組成
滅菌蒸餾水Xμl
2×PCR buffer for KOD -Multi & Epi-
25μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
亞硫酸氫鹽處理DNA ～200ng
KOD-Multi & Epi-(1.0U/μl)1μl
Total Volume50μl
Cycle
〈3步法循環〉
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
Tm℃, 30sec.
68℃, 15～30sec./kb 40 cycles
幾點建議
※Tm值采用最鄰近法（Nearest Neighbor method）計算得到的值。
引物的Tm值以及擴增產物的Tm值計算請點擊此處進入在線工具
長按屏幕識別二維碼
打開手機掃描二維碼
