在16℃條件下反應時，將DNA片段（0.5kb）的克隆效率與末端形狀進行比較。結果可見，突出末端的連接約5分鐘即可完成，而平滑末端及TA克隆30分鐘約完成70?80%。另外，平滑末端克隆及TA克隆時間超過1小時，到2小時為止，連接效率會逐漸提高。因此當克隆效率比較低時，可將反應時間提高至2小時左右可提高連接效率。

 將T載體（50ng, 25fmol）和具有良好擴增效率的未純化PCR產物（用Taq DNA polymerase擴增的0.5kb片段）按照各種比例混合，在該DNA溶液〈7.5μl〉中添加Ligation high Ver.2〈7.5μl〉，在16℃條件下反應30分鐘。然后，用10μl反應液對E. coli DH5α感受態細胞〈100μl〉進行轉化，用LB/Amp（X-Gal）培養基培養后點克隆數。結果可見，盡量少帶入PCR反應液可得到良好的結果?！∮捎谟眉兓蟮腄NA片段可得到高效率，因此當效率低下時，可使用純化后的PCR產物。