用途

Illumina公司二代測序用文庫定量

說明

GenNext^TMNGS Library Quantification Kit是illumina^®二代測序用的文庫定量試劑盒。

Illumina公司NGS測序儀上加載的文庫量對數據的數量及質量有很大影響。文庫量過少，簇密度就較低，得到的測序數據量就比較少。相反，文庫量過多，簇清晰度就變差，數據質量就會下降。因此，文庫的正確定量就變得非常重要。

文庫定量的方法有分光光度檢測法及熒光測定法，這些測定法中，因為測定的是全部的DNA，所以不能正確地測定對測序有效的包含P5、P7接頭的DNA的濃度。
GenNext^TMNGS Library Quantification Kit中，設計了能與Illumina公司采用的P5、P7序列配對的引物，來進行qPCR法分析，能準確地定量能夠結合在Flow cell的文庫。另外，因為使用了KOD SYBR^®qPCR Mix，針對長鏈及GC富集的目的片段，也可以穩定進行文庫定量。

我們提供了文庫濃度計算工具，方便進行定量后的分析。請點擊此處進入在線工具或下載計算軟件本地操作。

特征

●低偏差的正確定量

使用了KOD SYBR^®qPCR Mix，不易受文庫GC含量及長度影響，無論何種文庫都可以正確地定量。使用本試劑盒定量得到的值，可以得到穩定的簇密度。

●可以較廣的范圍內進行定量

備有從20pM至0.0002pM的6個濃度的Standard DNA，能夠在較廣的范圍內正確地定量。

●簡便

本試劑盒含有文庫定量必需的全部試劑（qPCR試劑、Primer Mix、Standard DNA及文庫稀釋用buffer），可以簡單地進行文庫定量。

實驗例

1. 不同目的片段長度時PCR效率的比較

用各公司的文庫定量試劑盒對附加有接頭序列的150~800bp的模板DNA進行分析，比較了PCR效率。結果顯示，其他公司的文庫定量試劑盒隨著目的片段長度的變長，可以看到PCR效率降低，本試劑盒沒有因目的片段長度變化而出現PCR效率下降。

2.各種GC含量的目的片段的PCR效率比較

用各個公司的文庫定量試劑盒對附加有接頭序列的各種GC含量的模板DNA進行分析 ，比較PCR效率。結果顯示：其他公司的文庫定量試劑盒在定量GC含量高的目的片段時，如融解曲線分析圖所示，不能確認目的片段的擴增，PCR效率也不能測定。另一方面，使用本試劑盒可特異地擴增全部的目的片段，而且各目的片段的PCR效率誤差也最小。

通常，含有CpG的啟動子區域或嗜熱菌等細菌中GC含量比較高。在對其進行文庫定量時，使用不易受GC影響的本產品就可以正確地進行定量。

3.使用易于形成二級結構的短鏈目的片段進行探討

將附加有接頭序列的miRNA(human let-7a)序列(144bp)和Standard DNA為模板進行分析得到的擴增曲線進行比較。將miRNA目的片段稀釋至20pM之后，按10倍的梯度進行稀釋，與試劑盒中添加的Standard DNA同時進行分析。

結果顯示，miRNA目的片段與Standard DNA的擴增曲線與各稀釋水平基本一致，PCR效率分別是97.8%（miRNA）和97.1%（Standard DNA），也基本相等。通過本次探討可以確認：像miRNA這樣的易于形成二級結構的短鏈目的片段，使用本試劑盒，也能夠準確地進行定量。

產品內容

?KOD SYBR^®qPCR Mix^*
KOD SYBR^®qPCR Mix
50x ROX reference dye

?Standard & Primer Set
Standard DNA 1～6^**
5× Primer Mix
50× Dilution Buffer

*含有1個套裝的KOD SYBR^®qPCR Mix (Code:QKD-201)。
**含有20 pM, 2 pM, 0.2 pM, 0.02 pM, 0.002 pM, 0.0002 pM 濃度的Standard DNA 。
※20 μl 反應體系500次份。