用途

PCR

說明

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶KOD -Plus-系列技術的基礎上，應用了本公司新開發的「延伸增強劑」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（約為Taq的80倍）的同時，通過抑制<停滯現象>，明顯提高了對微量模板DNA、長目的片段的擴增效率。

特征

●可對微量模板DNA進行高保真?高效率的擴增

通過應用延伸增強劑技術，即便是微量模板DNA也可對目的基因進行高保真?高效率的擴增。同時本酶具備高保真性（約為Taq的80倍），可準確地對低拷貝數模板的目的基因進行擴增。

※PCR錯配率是通過使用各種酶以人基因組DNA為模板擴增β-globin基因(2.4kb)，對PCR產物進行TA克隆后，對96個克隆進行測序分析，測得的結果。

●縮短了延伸時間<30sec./kb>（長目的片段更方便）

延伸時間從原產品的60sec./kb縮短到30sec./kb。對長目的片段的擴增更加方便。

●實現了各種引物同一循環條件

20mer以上的引物(Tm值>63℃)可先嘗試2步法。循環條件無需探討非常簡便。（請參考基本反應條件）
*Tm值采用最鄰近法(Nearest Neighbor method)計算得到的值。

●長目的片段的擴增
提高了延伸性，可對各種長度的目的片段進行擴增。已通過實驗確認可對24kb的基因組DNA進行擴增。

●采用熱啟動法，提高了PCR性能

原理

KOD DNA polymerase具有強有力的3’→5’核酸外切酶活性（校正活性），可準確地對目的片段進行擴增，作為克隆用PCR酶獲得了廣泛的好評。 然而，高保真性PCR酶在20?30循環以后，容易出現擴增無法持續的<停滯現象>。

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶：KOD -Plus-系列技術的基礎上，應用了本公司新開發的「延伸增強劑」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（約為Taq的80倍）的同時，通過抑制<停滯現象>，明顯提高了對微量模板DNA、長目的片段的擴增效率。

實驗例

1. Total RNA的各種基因全長ORF的擴增

以HeLa細胞來源的Total RNA逆轉錄后得到的cDNA（Total RNA 50 ng相當）為模板， 對各種蛋白激酶的ORF（open reading frame）的全長擴增。反應根據各PCR酶的推薦條件進行了30個循環。結果可見，只有用KOD -Plus- Neo的情況下，所有的基因都能得到明亮的擴增產物，所有的ORF都能迅速地進行克隆。

2. β-globin基因上各種長度區域的擴增效率?延伸性的比較

以人基因組DNA（50ng）為模板，對各種長度的β -globin 基因進行擴增。反應按各PCR 酶的推薦條件，進行了30個循環。結果顯示，只有用KOD -Plus- Neo 的情況下，17.5 kb 的片段能確認得到明亮的條帶。 而且，17.5 kb 以下的片段，用KOD -Plus- Neo 的得率要高得多。

產品內容

【KOD-401】
KOD -Plus- Neo (1U/μl)200μl ×1支
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]1ml ×1支
25mM MgSO4[KOD-2S]1ml ×1支
2mM dNTP [NTP-201]1ml ×1支

※50μl反應體系的情況下可使用200次。

組分:
50mM   Tris-HCl (pH8.0)
25mM   KCI
0.1mM  EDTA
1mM     DTT
0.05%    Tween^®-20
0.05%    Nonidet^®P-40
50%       Glycerol

活性的定義:

在75℃活性測定條件下，在30分鐘內攝入10nmoles的全核苷酸使成為酸不溶物時所需酶的活性定義為1U。

來源:

E.coli重組體

基本反應條件

滅菌蒸餾水X μl
2mM dNTPs5μl
25mM MgSO43μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)1μl
Genomic DNA～200ng
Plasmid DNA～50ng
cDNA～200ng（RNA相當）
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo5μl

Total Volume50μl

〈2 Step Cycle〉^*
94℃    2min.
         ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈3 Step Cycle〉^*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
Tm℃    30sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈Step Down Cycle〉^*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
74℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
72℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
70℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 15～30 cycles
        ↓
68℃    7min.

*引物的Tm值高于63℃的情況下，請用兩步法。
引物的Tm值在63℃以下，或用兩步法無法確認到擴增時，請嘗試用三步法。
此外，當擴增產物出現雜帶或彌散時，請嘗試Step down方法。

※Tm值采用最鄰近法（Nearest Neighbor method）計算得到的值。
引物的Tm值以及擴增產物的Tm值計算請點擊此處進入在線工具