用途

PCR

說明

KOD FX是在KOD DNA polymerase基礎上開發的高性能PCR試劑。
本酶具有出色的?擴增成功率?、「延伸性」和「擴增效率」，可對各種長度的目的片段進行PCR。
KOD FX是PCR成功率非常高，適合于各種實驗條件的PCR酶。
實際測序結果表明，KOD FX在PCR過程中，產生堿基錯配的頻率（錯配率）144535個堿基中僅為19個（保真性是Taq DNA polymerase的約11倍）。由此可見，KOD FX的保真性雖比KOD -Plus-、KOD -Plus-Ver.2和KOD -Plus- Neo要差一些，但仍可進行充分的克隆。通過本酶擴增的DNA片段的末端基本上都被平滑化。

特征

●高擴增成功率
對高GC含量的目的片段、細胞懸濁液、小鼠尾巴/植物裂解液、全血、霉菌、酵母等粗樣品也可進行高成功率擴增。

●超群的擴增效率
由于得率很高，因此即便模板量很少也可進行擴增。

●出色的延伸性
已確認：以λDNA為模板可以擴增出40kb；以人類基因組DNA為模板可擴增出24kb；以cDNA為模板可擴增出13.5kb。

●通過熱啟動提高了PCR的反應效率
通過將2種抗KOD單克隆抗體預混合在酶中，抑制了PCR反應前常溫狀態下的多聚酶活性和3'→5' Exonuclease活性?？贵w在PCR最初的變性步驟即發生失活，但對擴增反應沒有任何影響。

注：Buffer A的配置方法請點擊下載附件。

實驗例

1. 堿裂解法制備的鼠尾裂解液的擴增例

向直接PCR反應液中添加堿裂解法(請參照右邊的基本反應條件)制備的鼠尾裂解液0.5μl，以Mouse membrane glycoprotein(Thy-1)gene(M10246)為目的基因，用2步法循環，作30個循環的擴增。

結果顯示，只有使用KOD FX時，才可以確認到明確的擴增。堿裂解法，相比使用Proteinase K的方法，操作簡單，可以更加簡便地分析轉基因鼠的基因。

另外，擴增產物無須純化，以下是用幾種限制性內切酶消化處理的結果，可以確認擴增產物可被內切酶完全消化切斷。

2. 一步法制備的植物裂解液的擴增例

向直接PCR反應液中添加一步法(請參照右邊的基本反應條件)制備的番茄、煙葉、稻葉及精米裂解液1μl，以rbcL為目的基因，用2步法循環，作30個循環的擴增。

結果顯示，只有使用KOD FX時，才可以確認到明確的擴增。通過將一步法與KOD FX組合，就可以簡便地對植物基因進行分析。

3. 模板DNA量的探討

使用KOD FX與其他公司的PCR酶，比較了模板DNA的量與擴增效率。

擴增反應中，以0.1ng～100ng的基因組DNA為模板，以human β-globin 2.8kb為目的基因，50μl反應體系，引物15pmoles，KOD FX使用了1U，按2步法，作了30個循環的擴增。

結果顯示，相比其他公司的PCR酶，KOD FX可以得到更高的擴增效率。

產品內容

KOD FX(1U/μl)200μl×1支
2×PCR Buffer*[KFX-1B]1.7ml×3支
2mM dNTP**[NTP-201]1ml×2支
*含有終濃度2.0mM的Mg ²⁺ 。
** 使用本酶進行PCR時，請使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs，有時可能得不到良好的擴增性能。
※50μl反應體系的情況下可使用200次。

組分:
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.001% Tween ^® 20
0.001% Nonidet ^® P-40
50% Glycerol

活性的定義:
在75℃活性測定條件下，在30分鐘內攝入10nmoles的全核苷酸使成為酸不溶物時所需酶的活性定義為1U。

來源:
E.coli 重組體

基本反應條件

滅菌蒸餾水X μl
2×PCR buffer for KOD FX25μl
2mM dNTPs10μl（0.4mM）
各引物15pmoles each
模板1～50ng(Plasmid)
10～200ng(Genome DNA)
～200ng[RNA相當](cDNA)
～2μl(粗樣品)
〈一步法植物裂解液1μl〉
KOD FX (1U/μl)1μl(1U)

Total Volume50μl

〈2步法循環〉*
94℃ 2min.
↓
98℃ 10sec.
68℃ 1min./kb 25～40 cycles

〈3步法循環〉*
94℃ 2min.
↓
98℃ 10sec.
(Tm-5)℃ 30sec.
68℃ 1min./kb 25～40 cycles

〈Step down循環〉*
94℃, 2min.
↓
98℃, 10sec.
74℃, 1min./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
72℃, 1min./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
70℃, 1min./kb 5 cycles
↓
98℃, 10sec.
68℃, 1min./kb 15～25 cycles
↓
68℃, 7min.
*基本上以2步法循環進行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循環未見擴增時，請試一下3步法循環。另外，擴增10kb以上的目的片段時，如果出現Long PCR片段或非特異條帶及彌散，請試一下Step down循環。

※Tm值采用最鄰近法（Nearest Neighbor method）計算得到的值。
引物的Tm值以及擴增產物的Tm值計算請點擊此處進入在線工具

<堿裂解法>
1) 將鼠尾(約3mm)放入離心管中。
2) 添加50mM NaOH 180μl。
3) Vortex充分振蕩。
4) 95℃?10min.
5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。
6) Vortex充分振蕩。
7) 離心(12,000rpm, 10min.)
8) 取0.5～2μl上清進行PCR反應。
(鼠尾不會也無需完全溶解)

<一步法>
1) 將葉片(3mm)或精米(1粒) 放入離心管中。
2) 添加Buffer A* 100μl。
3) Vortex充分振蕩。
4) 95℃?10min.
5) Vortex充分振蕩。
6) 離心(12,000rpm, 10min.)
7) 取1μl上清進行PCR反應。
(植物組織不會也無需完全溶解)
*Buffer A:
 100mM Tris-HC(l pH9.5)
 1M KCl
 10mM EDTA