用途

PCR、RT-PCR

說明

本酶是來源于高度嗜熱菌Thermus thermophilusHB8的耐熱性DNA 聚合酶，經大腸桿菌表達生成的重組型酶。
本酶具有逆轉錄活性，該活性在Mn²⁺存在的情況下會得到強化。利用該性能，可以用同一酶在同一試管中進行逆轉錄反應和PCR反應。
另外，本酶耐熱性比Taq DNA 聚合酶高，對GC含量豐富的目的片段的擴增效率更出色。

特征

●高效率
與Taq DNA聚合酶相比，該酶對GC含量豐富的目的片段及粗樣品的擴增效率更出色。

●可用1酶體系完成RT-PCR
由于本酶在Mn²⁺存在條件下顯示RTase活性，只用本酶即可完成RT-PCR。
且本酶在60℃時可進行RT反應，因此適用于GC含量豐富的目的片段、容易形成高級結構的目的片段的擴增。

實驗例

1.使用Tth DNA Polymerase進行基因組PCR擴增

使用本酶，以50ng人的基因組為模板，進行PCR擴增長度180bp?1.3kb的目的片段。
結果可見，各模板都得到了良好的擴增。

使用本酶可對各種目的片段進行PCR擴增。

2.使用rTth DNA Polymerase進行RT-PCR的實驗例

使用本酶，以酵母Total RNA 1μg為模板，對actin(目的片段長180bp和300bp)進行RT-PCR、以及分別以人的Total RNA(100pg、10pg)對易于形成二級結構的18S rRNA(380bp)進行RT-PCR。
另外，對18S rRNA使用M-MLV RTase + Taq DNA Polymerase進行RT-PCR并進行了比較。

RT反應條件
含有0.2mM dNTPs、1mM MnCl₂、Reverse Primer 2pmoles/μl、10U RNase Inhibitor及5U rTth DNA Polymerase的RT Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl)20μl反應液，60℃、30min.進行反應。

PCR條件
按1×濃度添加10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3)、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5% Tween20)，然后添加Forward Primer，使終濃度0.4pmoles/μl、MgCl₂，使用終濃度為1.88mM，以終體積100μl的反應體系進行循環。

結果顯示，可以得到良好的RT-PCR結果。另外，可以確認：以易于形成二級結果的rRNA為模板進行RT-PCR，60℃條件下進行RT反應的rTth DNA Polymerase比在42℃條件下進行RT的M-MLV RTase能得到更強的擴增效果。
這次雖然是使用的rTth DNA Polymerase，但是使用Tth DNA Polymerase也沒有問題。
另外，一步法反應中進行RT和PCR反應時，推薦使用本酶的試劑盒「RT-PCR Quick Master Mix」。

產品內容

Tth DNA Polymerase(5U/μl) 50μl
10×Buffer[TTH-3R] 1ml
Dilution Buffer[TTH-3D] 1ml
2mM dNTPs[NTP-201]* 1ml

*用本酶進行PCR時，請使用dNTPs[NTP-201]。其他的dNTPs，有時不能充分發揮PCR性能。


組分:
10mM Tris-HCl(pH7.5)
300mM KCl
0.1mM EDTA
1mM DTT
1% Triton® X-100
500μg/ml BSA
50% Glycerol

10×Buffer組成:
100mM Tris-HCl(pH8.9)
800mM KCl
15mM MgCl2
1% Triton® X-100
1% 膽酸鈉
5mg/ml BSA

Dilution Buffer組分:
與組分相同。

活性的定義:
在75℃活性測定條件下，在30分鐘內攝入10nmoles的全核苷酸使成為酸不溶物時所需酶的活性定義為1U。

來源:
E.coli重組體