用途

Realtime PCR用cDNA的合成

說明

ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆轉錄酶『ReverTra Ace^®』開發的Realtime PCR用的逆轉錄試劑盒，是包含逆轉錄反應用的所有組分的5×濃度的完全預混型試劑，只需添加模板RNA和水即可迅速地開始反應。另外，由于采用了最適用于Realtime PCR用短鏈目的片段cDNA合成的反應組分，可在短時間內高效率地制備適用于Realtime PCR的cDNA模板。 

ReverTra Ace^®qPCR RT試劑盒(Code No.FSQ-101)采用了本公司高性能逆轉錄酶『ReverTra Ace^®』，反應效率非常出色。另外，通過改良，使得帶入到Realtime PCR反應體系中的逆轉錄反應液的影響降到最小，即使在PCR反應體系中添加20％體積的逆轉錄反應液，也能表現出良好的擴增線性。因此，最適合用于表達量較少的mRNA的高靈敏度檢測。由于精簡了試劑盒的構成，可非常簡便地進行操作。 

特征

●可得到更廣的可定量擴增區域

將Oligo dT 與Random Primer按最適比例預混，可均一、高效地在RNA全序列范圍內進行逆轉錄，因此可得到更廣的可定量擴增區域。

●與RealtimePCR試劑的配合性良好

采用了對RealtimePCR反應體系影響最小的組分，即使在PCR中添加最多20%的逆轉錄反應液，也可以得到很高的直線相關性。最適用于表達量少的mRNA的高靈敏度檢測。

●完全預混型試劑(僅FSQ-201)

本品為放置于-20℃也不會凍結的完全預混型試劑。只要添加模板RNA和水，就可以簡便高效率地合成cDNA，且重復性良好。

●容易配制逆轉錄反應的陰性對照(僅FSQ-201)

因為添附有相同的預混型no-RT對照，能夠方便地配制逆轉錄反應的陰性對照。

實驗例

1.模板RNA量的添加量對合成效率影響的探討

在ReverTra Ace^® qPCR RT Kit的反應體系(10μl)中，分別添加HeLa細胞來源的total RNA 0.5μg - 0.5pg，分別進行逆轉錄反應。然后，采用和實驗例2同樣的方法進行cDNA合成量的比較。結果可見，在探討的范圍內，模板RNA的量和cDNA的得率密切相關，但無論模板RNA量的多寡，仍可維持很高的cDNA合成效率。由此可見，在目的片段濃度有差異的樣品之間，逆轉錄反應效率的變化并不大，因此可將定量結果的誤差控制在最小范圍內。

2.與用其他公司產品cDNA合成量的比較

的cDNA量進行定量。結果可見，在使用本試劑盒的情況下，兩個目的片段都有最高的得率。

3. RNase H 處理與否對檢測靈敏度影響的比較以來源于HeLa細胞的total RNA 100ng為模板，使用ReverTra Ace^® qPCR RT Kit（藍線）及另外添附RNase H的B公司cDNA合成試劑盒，按各自推薦的實驗步驟進行逆轉錄反應(B公司試劑盒分別按RNase H處理（紅線）/未處理（橙線）兩種方法進行)。然后，按和實驗例1同樣的方法檢測β-Actin的擴增效果。結果顯示，用B公司的試劑盒RNase H未處理（橙線）的情況下，檢測效果大幅下降。而用ReverTra Ace^® qPCR RT Kit（藍線）進行反應，即便不追加RNase H處理也能顯示出很高的擴增效率。已經過實驗證明，用本試劑盒RNase H處理與否靈敏度相等。
※本試劑盒不包含RNase H處理步驟。

4.與其他公司預混型cDNA合成試劑的逆轉錄效率（cDNA合成量）的比

以HeLa total RNA 100ng為模板，按各公司試劑盒推薦條件進行逆轉錄，然后進行Realtime PCR對5種目的基因進行定量。結果顯示，使用本試劑盒的cDNA得率更高。 

產品內容

[FSQ-101]

5x RT Buffer 400μl

Enzyme Mix 100μl

Primer Mix 100μl

Nuclease-free Water 1000μl×2支

[FSQ-201]

5x RT Master Mix 400μl×1支

5x RT Master Mix no-RT Control 40μl×1支

Nuclease-free Water 1,000μl×2支

※各試劑盒均為10μl反應體系情況下，可以使用200次。

注意事項

本試劑盒中附帶的5x RT Master Mix 及 5x RT Master Mix no-RT Control不能用在本公司的姊妹產品 ReverTra Ace^® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Code No. FSQ-301)中〔組分不同〕。
請務必注意。

基本反應條件

[FSQ-101]
將RNA置于65℃，5min.
↓
置于冰上

滅菌蒸餾水 X μl
5x RT Buffer 2 μl
Enzyme Mix 0.5 μl
Primer Mix 0.5 μl
RNA 0.5pg～1μg
Total Volume 10 μl
↓
37℃, 15min.
98℃, 5min.

[FSQ-201]
將RNA置于65℃，5min.
↓
置于冰上

Nuclease-free Water　 Xμl
5x RT Master Mix 　　　2μl
RNA template 　1pg～1μg
Total volume 　　　　　10μl
↓
37℃, 10min.
50℃, 　5min.
98℃, 　5min.
4℃, 　　hold.