用途

Realtime PCR

說明

THUNDERBIRD qPCR Mix是在Taq DNA polymerase基礎上開發的高效率Realtime PCR用Master Mix（2×濃度）, 是Realtime PCR Master Mix系列的改良產品。 最適合用于以cDNA、病毒DNA為樣品的Realtime PCR分析。本系列產品有TaqMan^® Assay（Probe Assay）用及SYBR^®Green I用兩類試劑盒可供選擇。本產品通過采用新的增強劑等手段，對組分進行了根本性的改良，使得反應特異性和PCR效率有了飛躍式的提升，從而可得到更廣的可定量擴增區域（dynamic range），而且可適用于模塊型及毛細管型等各類儀器。 

特征

●均一地檢測各種目的片段
采用了新的增強劑，對各種目的片段PCR效率的波動可控制在最小范圍內。

●可以在較廣的范圍內進行檢測

通過特異且高效率的擴增，可以在較廣的測定范圍內進行分析。

●高特異性(降低了引物二聚體)

通過對組分的最優化，使得PCR的特異性更高。通過降低非特異性反應，使得SYBR^® Green I及TaqMan^® Assay等對低拷貝目的片段的檢測靈敏度更高。
(請參考實驗例)

●使用了高純度Taq DNA polymerase

PCR的基本性能得到了改善。

●適用于各類儀器

除適用于普通及高速的模塊型(Block Type)儀器外，還適用于使用玻璃毛細管(Glass Capillary Type)的高速循環儀。由于另外添附了50× ROX reference dye，對于使用Passive Reference的儀器(如Applied Biosystems公司制造的儀器、Stratagene公司制造的儀器)，可根據各種儀器的特征把ROX調整到最適濃度。

●高速hot start

本產品采用了抗Taq聚合酶抗體的熱啟動系統。由于通過升溫能使抗體迅速失活，因此預變性時間可以設定為很短。

實驗例

SYBR^®Green I檢測體系的反應特異性比較

使用β-Actin cDNA的引物對，比較了各Realtime PCR試劑的反應特異性。

引物對是能擴增人的β-Actin cDNA的引物，模板是使用本公司高性能的逆轉錄試劑「ReverTra Ace^®qPCR RT Kit [Code No. FSQ-101]」合成的HeLa細胞Total RNA來源的cDNA，將cDNA作10倍的梯度稀釋(4個梯度)，以no-template control(NTC)一起，分別作了復孔進行實驗。(使用Roche Diagnostics LightCycler^®1.1)

產品內容

【QPS-101T,QPS-201T】
qPCR Mix1ml ×1支
50X ROX reference dye50μl
(50μl反應體系40次，或20μl體系100次)

【QPS-101,QPS-201】
qPCR Mix1.67ml ×3支
50X ROX reference dye250μl
(50μl反應體系200次，或20μl體系500次)

基本反應條件

〈SYBR^® Green I 法〉
滅菌水Xμl
qPCR Mix10μl
Forward Primer6pmoles
Reverse Primer6pmoles
DNA樣品Yμl
50×ROX referencre dye0.4/0.04μl^*

Total Volume20μl

*50×ROX reference dye，是對于使用 Passive Reference 的儀器（如Applied Biosystems 公司制造的儀器等），為校正各孔間的熒光強度及分注誤差而使用。不用 Passive Reference 進行校正的儀器無需添加。

Cycle
〈2步法〉
95℃     20～60sec.
         ↓
95℃     1～15sec
60℃     30～60sec.
40 cycles

〈3步法〉
95℃     20～60sec.
        ↓
95℃     1～15sec
55～65℃  5～30sec.
72℃     30～60sec.

40 cycles

※退火溫度，請在引物的Tm~Tm-5℃的范圍內設定。
※目的片段在 300bp 以下時，延伸時間 30 秒即可進行充分的反應。但一部分儀器為了能夠測定到穩定的熒光，延伸時間需大于 30 秒。擴增曲線散亂，或各孔間的差異較大時，請設定較長的延伸時間（45-60 秒）。